Diagnostyka Preimplantacyjna PGD

Strona główna/Encyklopedia wiedzy/Diagnostyka Preimplantacyjna PGD

Diagnostyka Preimplantacyjna PGD

Z przyjemnością prezentujemy pierwszy odcinek unikalnego cyklu artykułów eksperckich opracowywanych przez Kliniki Leczenia Niepłodności INVICTA we współpracy z portalem ginekolog.pl. Co miesiąc na łamach naszej strony i portalu publikowane będę materiały merytoryczne, poświęcone szeroko pojętej problematyce diagnostyki i leczenia niepłodności.

Założeniem inicjatywy jest prezentacja profesjonalnego spojrzenia na zagadnienie i informowanie o najnowszych osiągnięciach medycyny w zakresie metod wspomaganego rozrodu. Artykuły przygotowywane są przez doświadczonego praktyka i naukowca, Kierownika Klinik Leczenia Niepłodności INVICTA, dr n. med. Krzysztofa Łukaszuka oraz zespół specjalistów.

Pierwszy odcinek pt.: „Diagnostyka preimplantacyjna” cyklu dotyczy możliwości wykorzystania innowacyjnej metody PGD w przypadku starających się o potomstwo par obciążonych chorobami genetycznymi. W kolejnych częściach Czytelnicy będą mieli okazję zapoznać się m.in. z opisem metod diagnozowania niepłodności, charakterystyką nowoczesnych metod wspomagania rozrodu oraz publikacjami na temat roli badań w tym procesie.

Mamy nadzieję, że artykuły okażą się cenną pomocą w codziennej pracy. Serdecznie zapraszamy do lektury.

Diagnostyka Preimplantacyjna PGD

Diagnostyka preimplantacyjna – (ang. Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD) jest metodą pozwalającą na ocenę materiału genetycznego komórek jajowych przed ich zapłodnieniem lub zarodków przed transferem do macicy [1]. Za pionierów idei PGD uważani są R.G. Edwards i R.L. Gardner, którzy w 1968 roku wykonali biopsję blastocysty królika w celu oceny płci [2]. Zastosowanie w 1989 roku diagnostyki preimplantacyjnej z udziałem ludzkich komórek rozrodczych rozpoczęło etap rozwoju tej dziedziny w zakresie jej możliwości diagnostycznych. W 1990 r. Handyside i wsp. opisał pierwszy przypadek ciąży po PGD u pacjentów z chorobą genetyczną sprzężoną z chromosomem Y (adrenoleukodystrofii) [3]. W wyniku badań z wykorzystaniem metody łańcuchowej reakcji polimerazy – PCR do macicy podano zarodki płci żeńskiej pozbawione ryzyka ujawnienia się tej choroby. W tym samym roku zespół pod kierownictwem Verlinsky przeprowadził z powodzeniem diagnostykę preimplantacyjną w kierunku innej jednostki chorobowej – mukowiscydozy [2]. Równoczesny rozwój technik diagnostycznych pozwolił na rozszerzenie możliwości diagnostycznych PGD. Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ – FISH (ang. Fluorescent In Situ Hybridization) pozwoliło na szybką analizę aneuploidii oraz aberracji chromosomowych w komórkach jajowych i zarodkach [4].

PGD stanowi wczesną formę diagnostyki prenatalnej powiązanej z technikami rozrodu wspomaganego [4]. Wskazania do wykonania PGD można podzielić na 2 grupy:

  • Grupa pierwsza, charakteryzująca się wysokim ryzykiem przeniesienia wad genetycznych na potomstwo:
    – jeden z partnerów jest nosicielem allelu recesywnego lub dominującego, bądź wzajemnej translokacji
    zrównoważonej [5]
    – pary, które kilkakrotnie musiały zdecydować się na terminację ciąży z powodu nieprawidłowych wyników
    badań prenatalnych
    – nawracające samoistne poronienia bez określonej przyczyny [4,6]
  • Grupa druga, obciążona niskim ryzykiem przeniesienia wad genetycznych na potomstwo, w której PGD
    wykonywane jest w celu zwiększenia szans na powodzenie procedury IVF (ang. In Vitro Fertilisation). Ten typ
    diagnostyki określany jest błędnym terminem PGS (ang. Preimplantation Genetic Screening):
    – zaawansowany wiek matki (>37 lat w przewidywanym terminie porodu), gdzie powodem może być
    zwiększone ryzyko aneuplodii w zarodkach [5]
    – brak pozytywnego efektu leczenia w przebiegu procedur ART (Assisted Reproductive Technics) [4,6].

W celu pobrania materiału do analizy genetycznej, na chwilę obecną stosowane są 3 metody:

1) Biopsja blastomeru – metoda stosowana najczęściej. Przeprowadzana jest w 3 dniu po zapłodnieniu. Do biopsji kwalifikuje się jedynie zarodki 6-8 komórkowe. Po otwarciu osłonki przejrzystej zarodka (mechanicznie, enzymatycznie lub światłem laserowym) pobierany jest 1 lub rzadziej 2 blastomery [5]. Transfer nieobciążonego genetycznie zarodka wykonywany jest w 5 dniu po zapłodnieniu komórki jajowej.

2) Biopsja I lub II ciałka kierunkowego. Ciałka kierunkowe są to fragmenty cytoplazmy w obrębie komórki jajowej, zwierające wyłącznie matczyny materiał genetyczny. Powstają podczas I i II podziału mejotycznego oocytu. Nie pełnią żadnej fizjologicznej funkcji w dalszym rozwoju zarodka. Procedura ich pobrania nie odbiega od stosowanej przy biopsji blastomerów. I ciałko kierunkowe pobierane jest z oocytu przez zapłodnieniem, natomiast II ciałko kierunkowe po zapłodnieniu. Metoda ta pozwala uniknąć ingerencji w materiał genetyczny zarodka. Ograniczeniem jest tu jednak niemożliwość diagnostyki materiału genetycznego przyszłego ojca, czy wykrywanie wad genetycznych powstałych w przebiegu rozwoju zarodka [5].

3) Biopsja komórek trofoektodermy (TF) zarodka. Wykonywana jest w 5 dniu po zapłodnieniu komórki jajowej. Komórki do analizy pobierane są z trofoektodermy. Zarodek do badania musi znajdować się w stadium blastocysty. Do badania pobiera się kilka komórek pochodzących z obszaru trofoektodermy. Badanie to ogranicza zakres wybranych chromosomów w sytuacji, gdy transfer zarodka planowany jest na piątą dobę.

Zaletą biopsji TF jest duża ilość materiału do badania, aczkolwiek krótki czas na analizę oraz brak pewności, że TF odzwierciedlają rzeczywiste DNA węzła zarodkowego ograniczają jej zastosowanie [5].

W diagnostyce preimpalntacyjnej do analizy genetycznej już od samego początku wykorzystywano PCR (łańcuchową reakcję polimerazy ang. Polymerase Chain Reaction) oraz FISH.

PCR umożliwia powielenie wybranego fragmentu DNA dzięki czemu otrzymujemy wiele jego kopii. PCR stosowane jest w diagnostyce chorób jednogenowych. Ograniczeniem PCR jest ryzyko kontaminacji obcego DNA (np. pochodzącego z plemnika, gdy jako procedurę zapłodnienia komórki jajowej stosowano klasyczną metodę zapłodnienia a nie ICSI). Kolejną wadą jest efekt allele drop-out (ADO), w którym jeden z alleli heterozygoty zostaje nieprawidłowo amplifikowany, czego konsekwencją mogą być zarówno fałszywie dodatnie jak i fałszywie ujemne wyniki. Zastosowanie zmodyfikowanych metod PCR takich jak multiplex PCR, fluorescencyjny PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym pozwalają uniknąć w/w problemów [5,9]. W diagnostyce PGD z wykorzystaniem PCR stosuje się również powielenie całego genomu badanej komórki – WGA (ang. Whole Genom Amplification). Procedura ta zalecana jest przy małej ilości materiału do badania [9]. Wyniki fałszywej oceny genetycznej zarodków dla chorób dziedziczonych autosomalnie recesywnie wynosi 2%, a dla cech dominujących 11% [10].

Diagnostyka PGD z wykorzystaniem techniki FISH wykorzystuje sondy fluorescencyjne w celu oceny aneuploidii autosomów, wykrywaniu chromosomów płci i aberracji chromosomalnych. Fałszywe wyniki oceny aneuploidii na podstawie 1 blastomeru wynosi 7%, z czego 6% to mozaiki, stąd też dla podniesienia czułości metody zaleca się biopsję 2 blastomerów [5].

Wyniki właściwej diagnozy PCR dla biopsji 1 komórki w porównaniu dla 2 komórek są następujące 88,6% i 96,4%. W przypadku FISH różnice nie są istotne statystycznie. Różnice wartości wskaźnika żywych urodzeń po PCR lub FISH nie były istotne statystycznie [12].

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH ang. Comparative genomic hybridization) i mikromacierz CGH (aCGH ang. Array comparative genomic hybridization) dopiero od kilku lat są wykorzystywane do selekcji zarodków o wyższym wskaźniku implantacji, diagnostyki anueploidii czy mozaicyzmu. CGH umożliwia analizę różnic w ilości kopii DNA całego genomu, tym samym daje szansę łączonej diagnostyki różnych mutacji punktowych lub mutacji punktowych i aneuploidii. Na chwilę obecną niewystarczająca skuteczność i złożoność opracowanych metod oraz wysokie koszty ograniczają ich stosowanie na większą skalę. Zdecydowaną wadą tych metod jest długi czas oczekiwania na wynik badania (CGH do 72 godz., aCGH do 30 godz.). Zarodki lub oocyty na czas badania muszą być poddane krioprezerwacji [3,16]. Witryfikacja jest nową metodą mrożenia zarodków i oocytów opracowaną przez M. Kuwayamę. Udowodniono, że zwiększa wskaźnik urodzeń zdrowych dzieci [17] oraz przeżycia zarodków po biopsji blastocysty w porównaniu ze standardowymi metodami krioprezerwacji [16]. Zhang i wsp. badali wskaźnik przeżycia wytryfikowanych zarodków na różnych stadiach rozwoju poddanych biopsji w 3 dniu od zapłodnienia w porównaniu do zarodków bez biopsji. Wyniki badania pozwalają postawić tezę, że embriony po biopsji, krioprezerwowane na wyższym etapie rozwoju mogą być po rozmrożeniu wykorzystane z zadowalającym efektem [18].

Na chwilę obecną możliwa jest teoretycznie PGD wszystkich chorób monogenetycznych: dziedziczonych autosomalnie dominująco (np. choroba Huntingtona, zespół Marfana, dystrofia miotoniczna), autosomalnie recesywnie (np. mukowiscydoza, β- talasemia, rdzeniowy zanik mięśni), chorób sprzężonych z płcią ( np. dystrofia mięśniowa Duchena, zespół łamliwego chromosomu X, hemofilia A) i aberracji chromosomalnych: aneuplodii, translokacji zrównoważonych oraz robertsonowskich [4].

Aneuploidie są znanym czynnikiem sprawczym niepowodzeń technik rozrodu wspomaganego i nawracających poronień. U około 70% zarodków powstałych w wyniku zapłodnienia IVF występuje co najmniej jeden z pięciu zaburzeń chromosomalnych (X,Y,13,18,21) [11]. Wraz z wiekiem matki rośnie ryzyko wystąpienia trisomii chromosomu 21. Potwierdzono zwiększone ryzyko poronienia, urodzenia martwego płodu lub z wadami wrodzonymi, w przypadku gdy jedno z rodziców jest nosicielem wzajemnej translokacji zrównoważonej [6]. Nosiciele wzajemnych translokacji zrównoważonych mają wyższe ryzyko wystąpienia poronień niż nosiciele translokacji Robertsonowskich. W grupie pacjentów z obciążeniem w wywiadzie nawracającymi poronieniami i brakiem żywych urodzeń PGD zmniejsza ryzyko poronień i zwiększa wskaźnik żywych urodzeń [13].

O ile skuteczność PGD dla grupy wysokiego ryzyka przekazania chorób genetycznych potomstwu jest udowodniona to stosowanie PGS budzi wiele kontrowersji. Geraedts i wsp. (2010) powołując się na randomizowane badania stwierdza, że PGS nie zwiększa wskaźnika żywych urodzeń u par z zawansowanym wiekiem matki, niepowodzeniami IVF/ICSI [14]. Ponadto PGS może w tej grupie obniżać wskaźnik ciąż i donoszonych ciąż [15].

Podsumowując diagnostyka preimplantacyjna stanowi alternatywę dla diagnostyki prenatalnej wśród par decydujących się na ART. Dzięki szerokim możliwościom diagnostyki chorób genetycznych daje nie tylko możliwość posiadania zdrowego potomstwa, ale również szansę na dziecko dla par z nawracającymi poronieniami czy niepowodzeniami ART, a także budzącym pewne kontrowersje doborem rodzeństwa pod względem zgodnego HLA w celu pozyskania komórek macierzystych z krwi pępowinowej np. w celu przeszczepu komórek macierzystych dla rodzeństwa [2].

Autorzy artykułu: A. Litwin, dr n. med. J. Liss, dr hab. n. med. K. Łukaszuk, prof GUM-ed

Bibliografia:
1. Liss J., Bruszczyńska A., Łukaszuk K. Preimplantation genetic diagnosis in prevention of genetic diseases – diagnostic of spinal
muscular atrophy (SMA). Ginekol Pol. 2010, 81, 918-921
2. Joe Leigh Simpson. Preimplantation genetic diagnosis at 20 years. Prenat Diagn 2010; 30: 682–695
3. Handyside A. H., Kontogianni E. H., Hardy K., Winston R. M. L. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed
by Y-specific DNA amplification. Nature 1990; 344, 768 – 770
4. Karen Sermon, André Van Steirteghem, Inge Liebaers. Preimplantation genetic diagnosis. Lancet 2004; 363: 1633–41
5. Adiga S.K., Kalthur G., Kumar P., Girisha K.M. Preimplantation diagnosis of genetic diseases. Postgrad Med 2010;56:317-20
6. Joep P. M. Geraedts1, Joyce Harper, Peter Braude, Karen Sermon, Anna Veiga, Luca Gianaroli, Noelle Agan, Santiago Munne, Sue
Gitlin, Elisabeth Blenow, Kylie de Boer, Nicole Hussey, Emmanuel Kanavakis, Soo-Huan Lee, Ste´phane Viville, Lewis Krey, Pierre Ray,
Serena Emiliani, Young Hien Liu , Stefan Vermeulen. Preimplantation genetic diagnosis (PGD), a collaborative activity of clinical genetic
departments and IVF centrem. Prenat Diag 2001; 21: 1086–1092.
7. De Vos A., Staessen C., De Rycke M., Verpoest W., Haentjens P., Devroey P., Liebaers I., Van de Velde H. Impact of cleavage-stage
embryo biopsy in view of PGD on human blastocyst implantation: a prospective cohort of single embryo transfers. Hum Reprod. 2009
Dec;24(12):2988-96. Epub 2009 Sep 21
8. Harton G.L., Harper J.C., Coonen E., Pehlivan T., Vesela K., Wilton L. ESHRE PGD Consortium Best Practice Guidelines for FISHBased
Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)
9. Claudia Spits, Karen Sermon. PGD for monogenic disorders: aspects of molecular biology. Prenat Diagn 2009; 29: 50–56
10. Lewis C.M., Pinêl T., Whittaker J.C., Handyside A.H. Controlling misdiagnosis errors in preimplantation genetic diagnosis:
a comprehensive model encompassing extrinsic and intrinsic sources of error. Hum Reprod. 2001 Jan;16(1):43-50
11. Munne S., Lee A., Rosenwaks Z., Grifo J., Cohen J. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.
Hum Reprod 1993 Dec;8(12):2185-91
12. Veerle Goossens, Martine De Rycke, Anick De Vos, Catherine Staessen, An Michiels, Willem Verpoest, Andre´ Van Steirteghem,
Catherine Bertrand, Inge Liebaers, Paul Devroey, Karen Sermon. Diagnostic efficiency, embryonic development and clinical outcome
after the biopsy of one or two blastomeres for preimplantation genetic diagnosis. Human Reprod. Vol.23, No.3 pp. 481–492, 2008
13. Tetsuo Otani, Muriel Roche, Miho Mizuike, Pere Colls, Tomas Escudero, Santiago Munné Preimplantation genetic diagnosis signifi
cantly improves the pregnancy outcome of translocation carriers with a history of recurrent miscarriage and unsuccessful pregnancies.
Reproductive BioMedicine Online Vol 13 No 6. 2006 869-874
14. Joep Geraedts, John Collins, Luca Gianaroli, Veerle Goossens, Alan Handyside, Joyce Harper, Markus Montag, Sjoerd Repping,
Andreas Schmutzler What next for preimplantation genetic screening? A polar body approach! Human Reprod. Vol.25, No.3 pp. 575–
577, 2010
15. Miguel A. Checa & Pablo Alonso-Coello & Ivan Solà & Ana Robles & Ramón Carreras & Juan Balasch. IVF/ICSI with or without
preimplantation genetic screening for aneuploidy in couples without genetic disorders: a systematic review and meta-analysis. J Assist
Reprod Genet (2009) 26:273–283
16. Zheng Y.M., Wang N., Li L., Jin F. Whole genome amplification in preimplantation genetic diagnosis. J Zhejiang Univ Sci B. 2011
January; 12(1): 1–11.
17. Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop metod. Theriogenology
2007 Jan 1;67(1):73-80.
18. Hang X., Trokoudes K.M., Pavlides C. Vitrification of biopsied embryos at cleavage, morula and blastocyst stage. Reprod Biomed
Online. 2009 Oct;19(4):526-31.

[/one_full]

Czy ten artykuł jest przydatny? 0 0

← Powrót
← Powrót do strony głównej
Published: 5 listopada 2015 Updated: 4 listopada 2016

Zakończyłaś program in vitro
niepowodzeniem?

Klinika Leczenia Niepłodności INVICTA - Klinika nr 1 w Polsce!

Skorzystaj z Bezpłatnej Konsultacji Lekarskiej
i spotkaj się z naszym ekspertem.